已結束 | 舊版 全部 新品 促銷 | 13 個活動進行中

【單克隆敲除株】我走過最多的路,是腫瘤研究的“套路”

活動品牌:和元生物| | 有效期:2022.05.01-2022.06.30

2022年5月的春風拂面而過,不知不覺中深埋在口罩里的高材生們,就到了一年的畢業季,此時很多應屆畢業的碩博都忙著寫文章投文章,搞的焦頭爛額,想要在畢業前的一點時間里做出屬于自己的學術成果。然而也有一些人,早早就拿到了文章接收函,此時正在跟自己的紅顏知己享受校園青春中最純粹的一段快樂時光。是因為實驗不努力么?是因為科研的敏感性差么?其實都不是的,在我看來,最大的原因在于不了解腫瘤方向發文章的“套路”。

為了解決這個問題,微風在這里選擇2022年5月發表在《CANCER GENE THERAPY》雜志,題為“CRISPR/Cas9-mediated knockout of PIM3 suppresses tumorigenesis and cancer cell stemness in human hepatoblastoma cells”的文章[1],與大家一起共同品味腫瘤研究中的“套路”。

 
01 背景介紹

肝母細胞瘤是一種具有多種分化方式的惡性胚胎性腫瘤。它是由胎兒性上皮性肝母細胞,胚胎性細胞以及分化的間葉成分組成,這種疾病多發生于小兒。對于此類腫瘤,手術切除是最為有效的治療方法,如果腫瘤是單發的、瘤體較小、位置表淺且無肝外轉移,手術切除可獲治愈。但是超過半數的患者在就診的時候就失去了手術機會。并且肝母細胞瘤對放療和化療均不敏感,因此找尋致病進程中的關鍵基因,克服現有治療方式的瓶頸顯得至關重要。

CRISPR/Cas9單克隆敲除株,是利用單鏈導向RNA通過堿基互補配對的原理靶向基因的結合位點,隨后Cas9核酸內切酶結合到與單鏈導向RNA形成雙鏈的基因區域進行切割。切割形成的雙鏈DNA斷裂在細胞內被修復,造成基因敲除的主要修復機制是非同源末端連接NHEJ,這種修復將產生短的核酸插入或者刪除從而導致基因移碼突變。目前構建單克隆細胞株的方式主要有電轉Cas9蛋白和gRNA、瞬轉Cas9-gRNA質粒、慢病毒侵染、轉座子構建 4種方式,目前主流的敲除株服務公司和高校及研究所的各個課題組,主要使用的是前3種方法。

圖1.CRISPR/Cas9敲除原理[2]

02 技術思路

(1)使用CRISPR/Cas9敲除技術構建HuH6細胞PIM6敲除單克隆細胞系,體外檢測增殖、周期、凋亡、遷移、侵襲等常規功能學。
(2)使用傳統的RNA-seq技術,確定PIM3敲除后下游信號通路的變化。
(3)使用過表達質粒,扭轉PIM3敲除,進行細胞功能學檢測。
(4)驗證PIM3敲除后,對于HuH6細胞干性的影響。
(5)體內實驗驗證PIM3敲除對于HuH6細胞皮下增殖能力的影響。
 
03 研究內容

作者首先通過瞬轉Cas9和gRNA表達載體的方式,構建了HuH6 PIM3KO單克隆細胞株。并通過Western Blot鑒定敲除細胞株的PIM3表達,選擇B11、D2、E8 3個敲除單克隆進行后續功能研究。作者分別使用了CTG法檢測細胞增殖、臺盼藍法檢測細胞存活、transwell法檢測細胞的遷移和侵襲能力、流式檢測了細胞的周期變化。

圖2.PIM3細胞功能檢測

作者通過轉錄組測序的方式,發現PIM3KO后,共有746個基因發生了顯著性表達改變,其中378個差異基因上調,368個差異基因下調。通過IPA分析,PIM3KO明顯出現了細胞死亡和分化基因的上調。其中CCR5信號通路是下調最為明顯的,而此通路已經明確證實可誘導癌細胞歸巢到轉移部位來促進腫瘤進展。除此之外,發現了一些細胞分化通路的激活,如FXR/RXR和LXR/RXR,這也證明了PIM3具有調節肝母細胞瘤去分化的功能。

圖3.轉錄組測序結果

作者使用過表達載體,在PIM3KO的細胞中做了回復,發現回復PIM3基因表達后,細胞增殖速度明顯增加,而遷移和侵襲能力也明顯得到了回復,證明PIM3的功能是真實可信的。

圖4.回復實驗

由于在轉錄組測序的結果中發現PIM3基因與細胞去分化有關,因此作者想驗證一下PIM3基因與腫瘤干性的關系,首先文章鑒定了干性最常規的指標CD133并通過成球實驗證實PIM3KO后明顯降低HuH6細胞干性。同時也測定了其他干性的biomarker,例如Oct4、Nanog、Sox2、Nestin,證實了PIM3確實影響腫瘤干性。

圖5.PIM3基因影響腫瘤干性

至此,作者完成了所有體外實驗,但是由于文章完整性的要求,又進行了體內實驗的檢測。首先構建了皮下移植瘤模型,測量了生長曲線和生存曲線,并用免疫組化檢測了KI67的表達,確定了PIM3KO后,會影響腫瘤的在體增殖。

圖6.PIM3基因功能在體驗證

總結一下,通篇文章只是證明了PIM3在肝母細胞瘤中的作用和機制這件很簡單的事情,就發表了影響因子在6分左右的文章。它值得學習的地方在于設計的套路,使用單克隆敲除株探索基因功能,使用測序發掘通路差異,最后再進行通路檢測和回復實驗,套路化明顯,思路直白清晰,非常合適碩士博士們模仿,快速發表文章。

參考文獻
[1]Raoud Marayati, Laura L. Stafman et al.CRISPR/Cas9-mediated knockout of PIM3 suppresses tumorigenesis and cancer cell stemness in human hepatoblastoma cells.Cancer Gene Ther. 2022 May ; 29(5): 558–572. doi:10.1038/s41417-021-00334-4.
[2]TianzuoZhan,NiklasRindtorff et al. CRISPR/Cas9 for cancer research and therapy.Seminars in Cancer Biology Volume 55, April 2019, Pages 106-119,doi:org/10.1016/j.semcancer.2018.04.001.



靠譜
以上活動最終解釋權歸 和元生物技術(上海)股份有限公司 所有

和元生物技術(上海)股份有限公司   商家主頁

地址:上海市浦東新區國際醫學園區紫萍路908弄19號樓
聯系人:張女士
電話:15800353038
傳真:021-55230588
Email:

日期 數量
2022-7 4
2022-8 5
2022-9 3
2022-10 0
2022-11 1
2022-12 0

想要及時獲得促銷信息?
您可以在微博上關注我們

促銷活動發布請聯系
Email:service@bioon.com
電話:021-54485309

返回頂部

免费看女人下部被啪流水照片