Nature心血管研究｜高效特異性感染中樞血管內皮細胞的AAV病毒載體

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來源：武漢樞密腦科學技術有限公司 2022-6-20 訪問量：101評論(0)

編者按：

腺相關病毒（AAV）發展的最新進展產生了工程化衣殼，能夠比自然產生的衣殼更有效地轉導中樞神經系統（CNS）中定義明確的細胞群。AAV載體作為一個快速且靈活在體內實現基因穩定表達的手段，與目前的遺傳學調控技術相結合，能極大的推進神經科學的變革。但是目前對于CNS病毒衣殼的研究主要集中在神經元和膠質細胞，對于特異性調節非神經元細胞的病毒衣殼的研究仍進展緩慢。

腦血管內皮細胞是表達在血管腔隙的一類中樞非神經元細胞群體，作為血腦屏障的重要組成部分，調節許多關鍵的生理過程。此外，內皮細胞在神經系統功能中起著至關重要的作用，越來越多的證據表明內皮細胞損傷是導致各種神經系統疾病的主要原因。毛細血管內皮細胞能通過調節細胞物質轉運維持血腦屏障的完整性，而靜脈內皮細胞似乎在神經免疫通訊中扮演重要角色。但是目前對于內皮細胞有限的研究手段阻礙了對內皮細胞功能進行具體而深入的研究。

到目前為止，只有兩種病毒載體被認為能夠有效在腦血管內皮細胞中表達，即AAV-PHP.V1和AAV-BR1，但是這兩類病毒都存在明顯的局限性。AAV-PHP.V1對感染的內皮細胞沒有選擇性，并且對于星形膠質細胞也有較高的趨向性。相比之下，AAV-BR1感染腦微血管內皮細胞具有相對的特異性，但該載體在動脈和靜脈血管內皮細胞的表達效率仍不清楚，并且最近研究發現，AAV-BR1在一些較大的血管節段的內皮細胞表達效率很低。

因此，小編在這里給大家推薦哈佛醫學院神經生物學顧成華教授聯合美國麻省理工學院、哈佛大學博德研究所Benjamin E. Deverman教授發表于《nature cardiovascular research》的研究論文“A high-efficiency AAV for endothelial cell transduction throughout the central nervous system”。作者研發出一類AAV9工程化的病毒衣殼—AAV-BI30，這是一種在中樞神經系統中特異而高效地轉導內皮細胞的衣殼。在相對較低的全身劑量下，該載體可轉導成年C57BL/6小鼠大腦、視網膜和脊髓脈管系統中的大多數動脈、毛細血管和靜脈內皮細胞。此外，研究人員還表明AAV-BI30在體內對多種小鼠品系和大鼠內皮細胞，在體外對人腦微血管內皮細胞都有較強的轉導能力，可實現跨物種的特異性表達。最后，作者還證明了AAV-BI30在中樞神經系統中實現高效和內皮特異性Cre介導的基因操縱的能力。這使得AAV-BI30非常適合解決神經血管生物學中突出的研究問題，有利于加深對正常生理中神經血管相互作用的認識，以及開發相關中樞疾病中治療內皮功能障礙的藥物。

一、AAV-BI30在小鼠和大鼠腦微血管內皮細胞中有效表達

為了開發出具有高效感染中樞神經系統內皮細胞能力的病毒衣殼，研究人員構建出一個AAV9衣殼文庫，希望能從中篩選出有效地感染人和小鼠內皮細胞的病毒衣殼。該文庫構建基于重組AAV的骨架AAV9-CMV-Express進行篩選，在感染的細胞中表達病毒衣殼基因，通過對病毒衣殼的mRNA進行測序，篩選出不同類型的病毒衣殼。通過兩輪篩選，發現AAV-BI30在各物種的腦微血管內皮細胞中具有較高的感染效率，并且在較低病毒劑量（1×1011 vg/每只）的情況下實現了在小鼠和大鼠的腦微血管內皮細胞的有效表達。

但是AAV-BI30對于肝細胞有較高的趨向性，并且導致肝細胞的形態異常。為了降低AAV-BI30對肝細胞的損傷，研究人員在病毒中加入肝特異性的miR-122重復序列，該載體在降低病毒肝臟趨向性的同時，保留了腦微血管內皮細胞的特異性表達。

為了研究AAV-BI30在腦微血管內皮細胞中的感染效率，研究人員設計了一種特殊的分析方案，即通過病毒的NLS-GFP和內皮特異性轉錄因子ERG的共定位來評估AAV-BI30的感染效率，該方案能快速識別出腦血管的單個內皮細胞。通過與AAV-BR1的對比，發現兩類病毒均有明顯的腦微血管內皮細胞的趨向性，但是AAV-BI30在微血管內皮細胞的感染效率明顯優于AAV-BR1。

圖1. AAV-BI30在小鼠和大鼠腦血管內皮細胞中有效表達

二、AAV-BI30在動脈和靜脈血管內皮細胞中有效表達

接著研究人員關注AAV-BI30在動脈和靜脈血管內皮細胞的表達效率，通過腦血管的冠狀切面或者矢狀切面可以評估AAV在毛細血管的感染效率，但該方案評估動靜脈毛細血管的表達效率存在明顯的局限性，因為動脈和靜脈不成比例的分布導致局部切面獲取的信息很有限，因此研究人員制備了完整的腦血管系統形態標記。發現AAV-BI30在62%的動脈血管內皮細胞和71%的靜脈血管內皮細胞有效表達，而作為對照的AAV-BR1僅在23%的動脈血管內皮細胞和35%的靜脈血管內皮細胞中表達。

為了進一步確認AAV-BI30在活體組織中的表達水平，研究人員使用在體雙光子技術對AAV-BI30的表達效果進行進一步確認。研究發現AAV-BI30（劑量為1×1011 vg/每只）在活體小鼠的動脈血管、靜脈血管和微小毛細血管內皮細胞中均穩定表達。因此，AAV-BI30在較低病毒劑量的情況下，就能實現腦血管內皮細胞的高效特異性表達。

圖2. AAV-BI30在動脈和靜脈血管內皮細胞中有效表達

三、AAV-BI30在視網膜和脊髓的內皮細胞中有效表達

目前對于中樞內皮細胞的研究大多集中在腦血管系統，但是視網膜和脊髓的血管系統對于血管生成、血腦屏障動力學特征以及神經血管病變中均具有重要作用，因此研究人員關注AAV-BI30對視網膜和脊髓血管系統內皮細胞的標記效率。

經過比較發現AAV-BI30在視網膜內皮細胞的感染效率顯著優于AAV-BR1：AAV-BI30感染了73%的淺叢動脈內皮細胞、81%的淺叢靜脈內皮細胞、69%的中間叢內皮細胞和75%的深叢內皮細胞。而AAV-BR1只感染14%的淺叢動脈內皮細胞、23%的淺叢靜脈內皮細胞、18%的中間叢內皮細胞和30%的深叢內皮細胞。

在脊髓血管內皮細胞中也發現AAV-BI30的感染效率顯著高于AAV-BR1，AAV-BI30可以感染76%的脊髓血管內皮細胞，而AAV-BR1只能感染46%的脊髓血管內皮細胞。因此AAV-BI30內皮細胞的特異性表達不僅僅局限于腦血管內皮細胞，并且在全腦內皮細胞中均能有效表達。

圖3. AAV-BI30在視網膜和脊髓的內皮細胞中有效表達

四、使用AAV-BI30對腦血管內皮細胞進行基因操縱

為了評估AAV-BI30對腦血管內皮細胞的基因操縱能力，研究人員使用Cre重組酶系統對病毒進行包裝（AAV-BI30：CAG-CRE-miR122-WPRE），并在Rosa26 Cre依賴的報告小鼠進行研究。發現病毒能驅動94%的內皮細胞發生基因重組。

使用AAV-BI30對腦血管內皮細胞進行功能研究，Caveolin-1（Cav1，小窩蛋白）在維持神經血管耦合、維持血腦屏障中具有重要作用。在Cav1-loxp小鼠使用AAV-BI30的cre病毒進行重組，發現AAV-BI30能顯著降低血管內皮細胞的Cav1的表達，但不會影響非血管內皮細胞的Cav1的表達。

以上結果說明AAV-BI30在腦血管內皮細胞的功能研究中具有重要的作用，在缺乏中樞內皮細胞標記的特異性轉基因小鼠的研究現狀面前，AAV-BI30有望成為特異性研究中樞內皮細胞功能的特異性干預手段。

圖4. AAV-BI30可對腦血管內皮細胞進行基因操縱

五、總結

綜上所述，本文研究人員通過構建AAV衣殼文庫，篩選獲得AAV-BI30，并且經過與目前唯二的腦血管標記病毒AAV-PHP.V1和AAV-BR1的對比，發現該病毒在更低的病毒劑量（1×1011vg/每只）條件下，能高效的在中樞不同類型血管內皮細胞中特異性表達，展現出了AAV-BI30在特異性研究腦血管內皮細胞功能的巨大潛力，有利于加深我們對腦血管內皮細胞生理功能的認識，有利于揭示腦血管內皮細胞在神經病理狀態的變化，為研究人員早日攻克腦血管功能障礙相關的神經和精神疾病提供重要保障。

想了解更多關于AAV在血管內皮中研究的應用，請看下篇推文。

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