【科研實用寶典】AAV在血管內皮細胞中的應用

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來源：武漢樞密腦科學技術有限公司 2022-6-20 訪問量：94評論(0)

一、血管結構

血管是指血液流過的一系列管道。血管內皮是血流和血管壁之間的界面。除角膜、毛發、指（趾）甲、牙質及上皮等地方外，血管遍布人體全身。血管從管腔面向外依次為內膜、中膜和外膜。按構造功能不同，血管分為動脈血管、靜脈血管和毛細血管三種。

動脈起自心臟，不斷分支，口徑漸細，管壁漸薄，最后分成大量的毛細血管，分布到全身各組織和細胞間。毛細血管再匯合，逐級形成靜脈，最后返回心臟。動脈從心臟將血液帶至身體組織，靜脈將血液自組織間帶回心臟，微血管（按血管分支的順序，微血管主要包括微動脈、毛細血管和微靜脈）則連接動脈與靜脈，是血液與組織間物質交換的主要場所。動脈與靜脈通過心臟連通，全身血管構成封閉式管道。人體內血管分布常具有對稱性，并與機能相適應，大的血管走向多與身體長軸平行，并與神經一起被結締組織膜包裹成血管神經束。

二、血管內皮細胞研究方向及研究方法

血管內皮細胞功能

人體血管內皮細胞覆蓋于血管內膜表面，是一種單層扁平上皮細胞。血管內皮細胞是作為血管壁與血液之間的天然屏障。完整的血管內皮細胞為血液中的凝血因子、抗凝因子以及血小板之間的相互作用提供了光滑的表面，同時參與凝血、抗凝及纖溶（纖維蛋白溶解）系統，便于維持凝血和抗凝之間的平衡狀態，保證血液在血管內正常流動。內皮細胞合成和釋放許多局部調節通透性、血管張力、平滑肌細胞生長和遷移、炎癥反應和血小板功能的因子。組織損傷時白細胞從血液中通過血管內皮遷移到組織中去。在急性炎癥情況下，中性粒細胞粘附到內皮細胞上，白細胞先遷移后滲出，然后向血管外遷移。血管內皮細胞還具有促進先天性和后天性免疫系統與血管壁相互作用的功能。

內皮細胞功能性障礙疾病

內皮細胞和血管系統的改變在人類最可怕的疾病的發病機制中起著中心作用，因為內皮細胞具有維護毛細血管通暢和功能的關鍵作用。內皮細胞直接參與外周血管疾病、中風、心臟病、糖尿病、胰島素抵抗、慢性腎衰竭、腫瘤生長及轉移、靜脈血栓形成以及嚴重的病毒感染性疾病。內皮細胞的功能性障礙是動脈粥樣硬化的先兆，也會導致動脈血栓的形成。

健康內皮（A）和功能失調內皮（B）。健康的內皮顯示血管舒張表型，包含高水平的血管舒張劑，如一氧化氮（NO）和前列環素（PGI2），以及低水平的活性氧（ROS）和尿酸。健康的內皮還具有由低水平的纖溶酶原激活劑抑制劑1（PAI-1）、血管性血友病因子（vWF）和P-選擇素（又名CD62P）組成的抗凝表型�？扇苄匝芗毎掣椒肿樱╯VCAM）、可溶性細胞間粘附分子（sICAM）、E-選擇素（CD62E）、C-反應蛋白（CRP）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）和白細胞介素-6（IL-6）的低水平表明可能存在很少的炎癥。最后，內皮祖細胞（EPCs，表明血管修復能力）的數量很高；而內皮微顆粒（EMPs）和循環內皮細胞（CECs）的水平很低，表明內皮壓力/損傷。在內皮功能失調的情況下，其表型特征包括血管擴張受損，氧化應激、尿酸、過氧化脂質自由基、**酪氨酸和一氧化二氮增加，以及促凝血和促炎癥表型，血管修復能力下降，EMPs和CECs數量增加。

工具病毒在血管內皮中的應用

案例一：利用AAV載體在視網膜血管內皮進行基因編輯

作者利用腺相關病毒（AAV：1E+12 vg/mL，1μL）將CRISPR-Cas9導入血管內皮細胞，開發了有效的體內基因組編輯方法。在該系統中，SpCas9的表達由特異性內皮啟動子細胞間粘附分子2（pICAM2）驅動，以限制只在血管內皮細胞中表達這種外源酶，AAV1可有效感染血管內皮細胞。通過在氧誘導視網膜病變（OIR）的小鼠模型中編輯視網膜血管內皮細胞中的VEGFR2（血管內皮細胞生長因子受體2）來舉例說明這種方法，并期望該簡化方案可以擴展到其他體內編輯內皮細胞基因組的研究中。

AAV載體在血管內皮細胞中基因治療的應用

案例二：利用腦血管內皮細胞AAV特異性載體治療新生小鼠色素失調癥

通過靜脈注射AAV-BR1（展示NRGTEWD肽的AAV2，具有良好的靶向特異性，在腦中轉基因表達很強，在非靶向器官中表達很少或沒有表達）-CAG-Nemo（6E+10 gp/每只，genomic particles/gp/基因組顆粒）使新生色素失調小鼠（Nemo-/+）的內皮細胞存活和血腦屏障通透性正�；�。

案例三：利用雙雜合AAV載體內皮靶向表達血管性血友病因子（vWF）

血管性血友病是臨床上常見的一種遺傳性出血性疾病，其發病機制是患者的血管性血友病因子（von Willebrand factor，vWF）基因突變，導致血漿vWF數量減少或質量異常。對vWF缺陷型（vWD）小鼠靜脈注射內皮特異性ICAM2（細胞間粘附分子2）-vWF或肝特異性hAAT（Human αl -antitrypsin promoter，人抗胰蛋白酶α1啟動子）-vWF雙雜交載體，注射劑量5E+11 vg/每只（血清型為AAV9mut，通過設計編碼每個七肽的重疊寡核苷酸而產生），成功表達了vWF基因。

圖1. 表達vWF的雙雜合AAV載體構建

圖2. 內皮或肝臟特異性雙雜交AAV載體誘導的vWD（血管性血友�。┬∈髒WF的表達

三、AAV感染血管內皮的血清型

研究顯示，不同血清型的AAV通過與特定受體結合，具有一定的組織趨向性�；贏AV血清型2（AAV2）的載體表現出廣泛的組織和細胞親和性，但AAV2載體不能有效地轉導血管內皮細胞，這是由于硫酸乙酰肝素蛋白多糖（Heparan sulphate proteoglycans，HSPG）將AAV-2隔離在細胞外基質中，從而阻止細胞進入和對蛋白酶體的敏感性。通過將從噬菌體線性展示中分離的七聚體肽SIGYPLP整合到AAV 2血清型衣殼的I-587位，設計了一個靶向血管內皮的rAAV載體（AAVsig）。

圖3. AAVsig介導增強的內皮細胞基因轉移。不同劑量的AAVwt和AAVsig感染不同內皮細胞（A：人臍靜脈內皮細胞（HUVEC）；B：人隱靜脈內皮細胞（HSVEC））以及β-半乳糖苷酶表達分析。

如圖所示，與傳統2型相比，AAVsig對臍靜脈內皮表達增加約5.9倍，對隱靜脈內皮細胞增加約28.2倍。

有研究通過在AAV 2血清型衣殼的I-587位插入不同的七聚肽重新篩選靶向血管內皮的AAV突變體，結果顯示AAV-VSSSTPR（AAV-VEC）和AAV-NNPLPQR（AAV-NEC）兩種病毒變體具有很強的選擇性，但AAV-VEC的轉導效率最高，是AAV2的2.7倍。更重要的是在GOI（Gene of Interest，簡稱GOI）為10000時，AAV-VEC的轉導效率是AAVsig的13倍。

另有研究顯示，通過類似的方法在AAV9衣殼位點A589插入兩種七肽RGDLRVS和SLRSPPS，以流式篩選熒光確認感染效率，并論證兩者對內皮細胞感染情況。

數據顯示，在人冠狀動脈內皮細胞（HCAEC）；人冠狀動脈平滑肌細胞（HCASMC）；肝腎等來源的永生化細胞（HEK293T，HeLa，911，HepG2）中rAAV9插入肽有效地提升了對內皮細胞的感染效率（SLRSPPS更優），但不具有內皮細胞靶向性。

有研究通過對AAV9血清型進行一系列改造，開發了一種新血清型AAV-BI30。AAV-BI30這種新血清型能夠特異且高效地轉導整個中樞神經系統(CNS)的內皮細胞。在小鼠、大鼠模型和體外人類微血管內皮細胞中均能穩定表達。

在C57BL/6小鼠靜脈注射AAV-BI30（AAV-BI30-CAG-NLS-GFP-WPRE載體，1.00E+11 vg/每只），10d后皮層和海馬中可見明顯的內皮細胞標記，而較少轉導外周器官微血管系統中的內皮細胞。

圖4. AAV-BI30標記小鼠皮層和海馬內皮細胞

在相同的注射條件下，AAV-BI30標記的小鼠腦內皮細胞數量明顯多于AAV-BR1。同時，AAV-BI30的表達在整個大腦中沒有明顯的區域間差異，即皮質、海馬、丘腦和小腦均表現出>80%的內皮細胞轉導。此外，與AAV-BR1不同的是，AAV-BI30具有高度內皮細胞特異性，標記神經元或星膠細胞的情況罕見。

圖5. AAV-BI30與AAV-BR1標記情況的差異

四、AAV感染血管內皮途徑及劑量‍

AAV感染血管內皮的方式主要有玻璃體腔注射、動脈注射、靜脈注射以及肌肉注射。有研究人員通過靜脈注射、肌肉注射、腹腔注射以及皮下注射對AAV感染效率進行評估，發現靜脈注射后AAV的感染效率最高。

五、血管內皮細胞疾病中常用的小鼠品系

血管內皮細胞疾病動物模型：

色素失調癥、血管性血友病、動脈粥樣硬化、氧誘導視網膜病變。

六、參考文獻

1.Wu W, Yang Y, Yao F, et al. AAV-mediated in vivo genome editing in vascular endothelial cells. Methods. 2021 Oct;194:12-17.

2.Körbelin J, Dogbevia G, Michelfelder S, et al. A brain microvasculature endothelial cell-specific viral vector with the potential to treat neurovascular and neurological diseases. EMBO Mol Med. 2016 Jun 1;8(6):609-25.

3.Barbon E, Kawecki C, Marmier S, et al. Development of a dual hybrid AAV vector for endothelial-targeted expression of von Willebrand factor. Gene Ther. 2021 Jan 17.

4.Nicklin SA, Buening H, Dishart KL, et al. Efficient and selective AAV2-mediated gene transfer directed to human vascular endothelial cells. Mol Ther. 2001 Sep;4(3):174-81.

5.Zhang L, Rossi A, Lange L, et al. Capsid Engineering Overcomes Barriers Toward Adeno-Associated Virus Vector-Mediated Transduction of Endothelial Cells. Hum Gene Ther. 2019 Oct;30(10):1284-1296.

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7.Krolak T, Chan KY, Kaplan L, et al. A High-Efficiency AAV for Endothelial Cell Transduction Throughout the Central Nervous System. Nat Cardiovasc Res. 2022 Apr;1(4):389-400.

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